6163am银河线路席鹏课题组与合作者在活细胞超分辨成像领域做出新突破，翻开了活细胞线粒体STED（Stimulated Emission Depletion Microscopy）长时程观察的新篇章。该工作开发了一种新型线粒体染料MitoESq-635，其饱和光强相较于传统的ATTO 647N降低3.4倍，有利于长时间STED超分辨成像。利用这一优势，该工作实现了对活细胞线粒体长达50分钟的活细胞动态观测，达到了35.2纳米的超高分辨率，观测到了线粒体聚合以及分裂的动态过程。该成果于7月24日在线发表在Nature子刊《自然·通讯》(Nature Communications)上。

线粒体是细胞的“发电厂”，其内部具有丰富的线粒体嵴用于ATP合成。由于它具有自己独立的DNA，其也经常被认为是远古细菌入侵细胞并形成共生关系的一种典范。同时，在癌症等疾病中，由于新陈代谢异常，线粒体嵴也呈现异常。然而，受到衍射极限的影响，传统显微镜只有300nm左右的分辨率，无法观测线粒体嵴这类细微结构。STED超分辨技术因其超高分辨率和较快的成像速度，适用于研究线粒体嵴结构。但是STED技术通常需要较高的光强实现超分辨，对于线粒体的毒性极高，且普通染料很容易被光漂白。该项目所研发的新型线粒体染料MitoESq-635有较低的饱和功率，实现相同的分辨率只需要相对更低的STED光强，降低了光漂白的效果；同时有较高的稳定性，能够长时间照射仍保有较强的荧光强度。共定位结果显示该染料能特异性标记线粒体。这些特性使得它成为活细胞线粒体长时间STED超分辨成像的最佳染料之一。

利用这一染料结合STED超分辨技术，该工作实现了三维切片STED成像，提供了丰富的线粒体三维立体信息。该技术的动态超分辨的观测能力，推动了对线粒体动态过程的定量分析。随着拍摄时间的增加，线粒体的宽度会逐渐变大，荧光强度会缓慢下降，图像分辨率也会下降。通过合理地定量分析找到了合适的STED照射光强，平衡了分辨率、信噪比、拍摄时间等几个方面的参数。

该项目清晰地观察到了线粒体聚合以及分离的过程，对比与普通共聚焦显微镜，该技术实现了35.2纳米的超高分辨率，清晰地看到了线粒体嵴的动态变化。同时观察到了线粒体聚合在一起，以及分离开来的动态过程，对线粒体形态学和功能变化的研究有着重要意义。对比电子显微镜的图片，该项目在动态成像的基础上观察到了类似的线粒体结构，也进一步验证了该技术的超高分辨能力。

6163am银河线路席鹏教授提到：成像技术的发展目标不外乎“清”，“快”，“深”，“活”（“轻快生活”）四个字，本项目正是在这四字方针的指导下，向“清晰”，“快速”，“深层”，“活体”这四个方面研究突破，实现了35.2纳米的超高空间分辨率，同时可以达到0.66秒每帧的较高时间分辨率，较深的三维切片成像，以及长达50多分钟的活细胞动态成像。

该工作的共同第一作者杨旭三是6163am银河线路毕业博士生（导师席鹏），目前在康奈尔大学进行博士后研究，共同第一作者杨志刚是深圳大学光电工程学院教授，共同一作吴朝阳是6163am银河线路博士生（导师席鹏）。共同通讯作者分别为：席鹏，屈军乐（深圳大学），杨志刚（深圳大学，共同一作），杨旭三（共同一作）。

图 活细胞线粒体STED长时程成像。（a）线粒体动态成像结果； （b）共聚焦和STED对比； （c）强度分布展现了35.2纳米分辨率

席鹏课题组近年来致力于超分辨技术的开发与应用，如：1) 综合利用上转换纳米探针的光子雪崩和交叉驰豫特性，实现了上转换低功率STED，将饱和光强降低两个数量级以上(Nature 2017)；2) 利用反射驻波光场调控成功实现19 nm的STED超分辨成像，达到目前STED生物样品成像分辨率的最高纪录，并对细胞核孔和病毒丝进行成像 (Light 2016)；3) 利用高斯-贝塞尔光场调控，将STED成像的轴向深度提升一个数量级(Laser Photonics Review 2016)；4) 结合偏振与结构光实现荧光偶极子超分辨成像(Light 2016，Nature Communications 2019)，并两次得到Nature Methods的研究亮点评价。这些工作为本工作奠定了坚实基础。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-17546-1